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点击次数：4413 发布时间：2015/1/19 17:05:45
一、 实验目的
掌握细胞保存的方法，能独立地进行细胞的冻存与复苏操作。
二、实验原理
细胞冻存是细胞保存的主要方法。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到保种的作用。此外，还可以利用细胞冻存的形式购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
细胞冻存时向培养基中加入保护剂——终浓度5%-15% 的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，在细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
采用“慢冻快融”的方法能较好的保证细胞的存活。标准冷冻速度为-1~-2℃/min，当温度低于-25℃时加速，到-80℃之后直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。
三、仪器、试剂和材料
仪器：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加样器、水浴锅、离心机。
材料：冻存管、细胞培养用材料、500ml烧杯、胶布、搪瓷杯、75%酒精棉球。
试剂：培养基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)或甘油、0.5%台盼篮染液、液氮。
四、实验步骤
(一)细胞冻存
1、取待冻存的细胞用胰酶消化，用培养基将细胞冲洗下来。800r/min离心5min，弃上清收集细胞。如果是悬浮培养的细胞，可直接离心收集细胞。
2、加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基，或是10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3*106个/ml左右，并可适量增加小牛血清浓度至20%。
3、细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记(注明细胞种类、时间、条件等)。
4、冻存管在4℃下存放30min，转放-20℃1.5h~2h，再转入-70℃4~12h后即可转入液氮内(-196℃)，注意进行登记。
(二)细胞复苏
1、取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。
2、从液氮中取出冻存管立即投入40℃水中迅速解冻。
3、取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开。
4、离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗1次，加入3ml新鲜培养基，于小培养瓶中培养。
5、每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满后进行传代培养。
五、注意事项
1、在使用含有DMSO的冻存液时，因为DMSO在室温状态易损伤细胞，所以在细胞加入冻存液后应尽快放入4℃环境中。
2、准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者信息。
小结：这里总结了细胞的冻存复苏操作技术，希望对大家有用。如有需要可以与我们联系。
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