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点击次数：1135 发布时间：2015/5/29 16:19:57
CD68免疫组化试剂盒说明书，上海心语生物科技有限公司专业生产商
该试剂盒以HRP标记的链霉亲和素复合物（HRPStreptavidinConjugate，HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性CD68抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的CD68一抗与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异性结合，*后加入HRP-SA，形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA复合物，显微镜
CD68免疫组化试剂盒所含试剂：
试剂A通透液：0.1%Triton-X10010mL（选用）
试剂B封闭缓冲液（封闭用）20mL
试剂C（原装进口分装）已稀释的即用型CD68一抗（2.5ml）
试剂D（原装进口分装）生物素化羊抗兔IgG1支
（浓度1.5mg/mL，稀释比为1:300~1:500）50μL+抗体稀释液20ml
试剂EHRP-SA复合物1支（浓度1μM，稀释比1:50~1:200）100μL
试剂FDAB显色液5ml
用户自备试剂：
1．10mMTBS（pH7.2~7.4）
三羟基氨基甲烷1.21g
氯化钠7.6g
加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH值至7.2~7.4，*后定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween20（0.05%体积比）
2．抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液）
10mMpH6.0柠檬酸缓冲液
柠檬酸0.38g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH值至6.0，*后定容至1000mL
或：0.5MEDTA修复液（pH8.0）
EDTA·2H2O186.1g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水700mL，用10mMNaOH调pH值至8.0，*后定容至1000Ml
3.缓冲甘油封固剂10mL
4.Tween205mL
石蜡包埋组织切片免疫染色
实验步骤（建议方案）：
石蜡包埋组织切片3~4μm厚度
1.烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1hr；
2.脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10min；
3.水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%
乙醇2min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O洗2×2min；
4.抗原修复：根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）*注：有些抗原勿需修复，直接进入第5步封闭。
5.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育30min；
6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗），37℃湿盒孵育2hr或4℃过夜；
7.洗涤：TBS-T洗涤（3×5min）；
8.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育10min；
9.加二抗：滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育30min；
10.洗涤：TBS-T洗涤（3×5min）；
11.封闭：滴加试剂Tween20，37℃湿盒孵育封闭20min；
12.加HRP-SA：滴加用试剂C稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20nM），37℃湿盒中孵育30min；
13.洗涤：TBS-T洗涤（3×5min），TBS洗涤（2×5min）；
14.显色：应用DAB溶液（试剂F）显色；
15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；
16.封片：待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；
17.观察成像：显微镜下观察成像。
CD68免疫组化试剂盒注意事项：
1.修复后缓冲液须自然冷却，自来水冲洗后方能把切片取出，骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。
2.缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
3.若试剂为微量浓缩液，用前应低速离心，将内盖和管壁附着的溶液离到底部。
4.封片前一定要换用TBS充分洗涤，以便洗去组织上残留的Tween20，否则会影响结果观察。
5.如须复染细胞核，则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片。
CD68免疫组化试剂盒抗原修复方法
常用抗原修复液：柠檬酸缓冲液（0.01MpH6.0）、EDTA抗原修复液（pH8.0或9.0）等等。
一、酶消化修复法
切片脱蜡水化处理，TBS冲洗，在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育20~30min后TBS冲洗即可。
二、微波抗原修复法
微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档或高档继续微波10~15min，取出微波盒冷却至室温后，自来水冲洗，取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异，须自行调整。
三、直接高压抗原修复法
取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾，将组织切片置于耐高温切片架上，修复液沸腾后放入切片架，盖上锅盖，待喷气后计时1.5~2.5min即可脱离热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
四、隔水式高压抗原修复法
不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾，微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸腾，将切片放入微波盒中，再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖，待喷气后计时4~8min即可关闭热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
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